細胞活性是指樣本群體中健康細胞所占的比例,受培養參數改變、藥物、生長因子及各種疾病因素影響。例如,癌細胞活性增強,引起細胞異常增殖、逃避細胞凋亡;神經退行性疾病和其他組織退行性疾病則表現為程序性細胞死亡;損傷和感染也會對細胞存活產生負面影響, 因此細胞活性檢測對于確認細胞生理狀態是必須的。
目前已經開發用于不同實驗平臺的多種細胞活性檢測技術。通常根據檢測原理可分為基于質膜完整性和基于代謝(如ATP代謝和線粒體NADH)的檢測方法。
臺盼藍,也稱二胺藍(Diamine Blue)和加拉藍(Niagra Blue), 是組織和細胞培養中最常用的死細胞鑒定染料之一?;罴毎毎そY構完整,能夠排斥臺盼藍,細胞不被染色;通常認為如果細胞膜喪失完整性,即是死細胞。死細胞的胞膜不完整,通透性增加,臺盼藍可滲入并將細胞染成藍色。由此可以簡單、快速地區分活細胞和死細胞。值得注意的是,如果長時間染色,臺盼藍可通過胞吞或胞飲作用進入細胞。因此染色時間不宜太長, 3~5分鐘即可,否則活細胞也會逐漸積累染料而染成顏色,使檢測結果偏低。
當兩種染料均存在于細胞核內,在合適的吖啶橙、碘化丙啶配比下,兩種染料發生能量共振轉移,死細胞在綠色通道下激發出紅色熒光。由于吖啶橙和碘化丙啶為DNA結合染料,因此可有效排除雜質以及紅細胞的干擾,確保對樣品進行準確計數。
羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)是一種可穿透細胞膜的熒光染料,CFSE進入細胞后,可以不可逆地與細胞內的氨基結合,偶聯到細胞蛋白質上。當細胞分裂時,CFSE標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中,因此其熒光強度是親代細胞的一半。在一個增殖的細胞群中,各連續代細胞的熒光強度呈對半遞減,利用流式細胞儀在488nm激發波長和516nm檢測波長進行分析。常用于淋巴細胞的增殖檢測,也可以用于成纖維細胞、NK細胞等其它細胞的增殖檢測,甚至還可以用于細菌增殖的檢測。
MTT比色法,是一種可用于檢測細胞活力的代謝性檢測方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶(SDH)能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚,用酶標儀在570nm波長處測定其光吸收光值,可間接反映活細胞數量。
MTT法是較早且較為經典的方法。但由于MTT法形成的甲瓚是非水溶性的,需要加有機溶劑溶解,這不僅增加了研究人員的工作量,也給實驗帶來了一定的誤差。一種升級的檢測方法出現了Cell Counting Kit-8,簡稱CCK-8。
CCK-8細胞活性檢測試劑中含有WST-8,一種類似于MTT的化合物,在電子耦合試劑存在的情況下,可以為線粒體內的脫氫酶驗明正身。在脫氫酶作用下,WST-8被還原生成橙黃色的甲瓚產物,用酶標儀在OD 450nm波長處測定其光吸收值。細胞增殖越多越快,則顏色越深;細胞毒性越大,則顏色越淺。對于同樣的細胞,顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。
CCK-8操作比MTT要簡單,生成的有色物質是橙黃色、可溶于水,在顯色后可直接比色。加入CCK-8后的細胞液仍可以繼續培養細胞,對細胞毒性相對較小。CCK-8法雖說是MTT法的完美升級版,但是CCK-8試劑的顏色為淡紅色,與含酚紅的培養基顏色接近,在檢測時容易漏加或多加。